Il silenziamento epigenetico da parte del complesso SMC5/6 media l'HIV

Sep 15, 2023

Nature Microbiology volume 7, pagine 2101–2113 (2022)Citare questo articolo

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Dopo l’ingresso virale e la trascrizione inversa, i provirus HIV-1 che non riescono a integrarsi vengono silenziati epigeneticamente, ma il meccanismo sottostante è rimasto poco chiaro. Utilizzando uno schermo knockout CRISPR/Cas9 su tutto il genoma, abbiamo identificato il complesso ospite SMC5/6 come essenziale per questo silenziamento epigenetico. Mostriamo che SMC5/6 si lega e quindi SUMOila il DNA dell'HIV-1 cromatinizzato non integrato. L'inibizione della SUMOilazione, mediante mutagenesi puntiforme del componente SMC5/6 NSMCE2, una ligasi SUMO E3, o utilizzando l'inibitore della SUMOilazione TAK-981, previene il silenziamento epigenetico, consente la trascrizione dal DNA dell'HIV-1 non integrato e salva la replicazione del DNA carente di integrasi HIV-1. Infine, mostriamo che il blocco dell'espressione del complesso SMC5/6, o l'inibizione della sua attività di SUMOilazione, sopprime l'instaurarsi di infezioni latenti da HIV-1 sia nelle linee cellulari T CD4+ che nelle cellule T umane primarie. Collettivamente, i nostri dati mostrano che il complesso SMC5/6 svolge un ruolo diretto nel mediare l'instaurazione della latenza dell'HIV-1 silenziando epigeneticamente i provirus HIV-1 competenti per l'integrazione prima dell'integrazione.

L'integrazione del DNA provirale nel genoma della cellula ospite è una caratteristica distintiva del ciclo di vita retrovirale che è essenziale per la trascrizione e la replicazione provirale1,2. Gli inibitori dell'integrasi (IN) inibiscono potentemente la replicazione dell'HIV-13. In assenza di IN funzionale, i provirus HIV-1 non integrati accumulano segni epigenetici repressivi, inclusa la trimetilazione della lisina 9 sull'istone H3 (H3K9me3), e sono privi di segni di attivazione, come l'acetilazione di H3 (H3Ac)4,5. Sebbene il silenziamento epigenetico della trascrizione dal DNA dell'HIV-1 non integrato rappresenti probabilmente una difesa dell'ospite contro il DNA estraneo, i meccanismi sottostanti e i fattori cellulari che mediano questo effetto rimangono non completamente definiti6,7.

Nel virus della leucemia murina (MLV), uno screening genomico ha identificato i componenti del complesso dell'hub di silenziamento umano (HUSH), nonché la proteina legante il DNA NP220, come fondamentali per il silenziamento del DNA MLV non integrato8. Tuttavia, il lavoro successivo9,10 non è riuscito a rilevare alcun ruolo del complesso HUSH o NP220 nel silenziare l'HIV-1 non integrato. Più recentemente, uno screening di 1.217 geni umani risultati sottoregolati dalla proteina Vpr dell'HIV-1 ha identificato come critico un componente del mantenimento strutturale del complesso cromosomico (SMC) 5/6, il fattore di localizzazione del complesso SMC5/6 2 (SLF2). per il silenziamento del DNA dell’HIV-1 non integrato. Questo screening ha anche mostrato che altri sei componenti del complesso SMC5/6, inclusi SMC5 e 6, nonché le quattro proteine ​​associate a SMC5/6 per il mantenimento non strutturale degli elementi cromosomici da 1 a 4 (NSMCE1–4), ma non SMC5/ 6, il fattore SLF1 associato, sono risultati fondamentali anche per il silenziamento epigenetico del DNA dell'HIV-1 non integrato9. Da notare che in precedenza è stato dimostrato che il complesso SMC5/6 viene degradato dalla proteina non strutturale HBX del virus dell'epatite B (HBV) e, in assenza di HBX, anche il DNA episomiale dell'HBV viene silenziato epigeneticamente11,12. Pertanto, il complesso SMC5/6 non solo partecipa alla replicazione, ricombinazione e riparazione cromosomica13, ma può anche silenziare il DNA virale invasivo. Qui abbiamo cercato di determinare se il complesso SMC5/6 media l'instaurarsi di infezioni latenti da HIV-1.

Per identificare i fattori che silenziano trascrizionalmente il DNA dell'HIV-1 non integrato, abbiamo eseguito uno screening knockout CRISPR/Cas9 su tutto il genoma14 nella linea di cellule T CD4+ umane CEM-SS. Abbiamo trasdotto un subclone CEM-SS che esprime Streptococcus pyogenes Cas9 con una libreria lentivirale che esprime circa 80.000 RNA a guida singola (sgRNA) destinati a 19.114 geni umani15. Sette giorni dopo, abbiamo infettato queste cellule con IN-NL-GFPΔEnv10, un derivato dell'HIV-1 che ospita una delezione in env, la mutazione inattivante D64V16 in IN e il frame di lettura aperto della proteina fluorescente verde (GFP) al posto di nef. Questo virus conserva copie intatte degli altri sei geni dell'HIV-1, incluso vpr. A 48 ore dopo l'infezione (hpi), le cellule GFP+ sono state raccolte mediante sorting cellulare attivato a fluorescenza (FACS), gli sgRNA recuperati mediante PCR (reazione a catena della polimerasi) quindi clonati nello stesso vettore lentivirale. Dopo tre cicli di selezione per le cellule GFP+, gli sgRNA sono stati sequenziati e analizzati per l'arricchimento rispetto alla libreria di sgRNA iniziale. Come mostrato nel grafico del vulcano in Fig. 1a, abbiamo identificato 9 geni che erano arricchiti> 16 volte e avevano un valore P <0,0005. Questi includevano 3 recettori sulla superficie cellulare (LY9, OR52N2 e SSTR2) e 1 proteina motrice (MYO1B) che non sono stati ulteriormente analizzati. Questa analisi ha anche recuperato 4 degli 8 componenti noti del complesso SMC5/6, vale a dire SMC5, SMC6, SLF1 e NSMCE3, nonché la proteina di riparazione del DNA SWI5 (Fig. 1a).